高效液相色谱-质谱联用法测定水果蔬菜中的多菌灵残留量方法的研究

【关键词】高效液相色谱 质谱 多菌灵 农药残留 水果 蔬菜

多菌灵(Carbendazim)又称苯骈咪唑44号，化学名称为2-(甲氧基氨基甲酰)苯骈咪唑，是一种广谱、高效、内吸性杀真菌农药，对菌核病、炭疽病、枯萎病等都有防治效果，已广泛应用于水果蔬菜生产。由于其化学性质稳定，能够持久地残留在果品蔬菜中，导致多菌灵残留累积，可通过食物链影响人体健康。研究表明，多菌灵能引起肝病，还能导致染色体畸变等病症[1]。目前测定多菌灵的分析方法主要有液相色谱法[2，3]、分光光度法[4]。高效液相色谱法常用紫外检测器，由于其选择性差，灵敏度受到限制，不同的样品必须采用不同的色谱条件，对检测干扰极大，方法的通用性和耐用性不强。为此，本实验采用高选择性、高灵敏度的质谱检测器，以常见水果蔬菜为研究对象，建立了检测多菌灵残留的液相色谱-质谱联用方法。

实验部分

主要仪器与试剂：1100型高效液相色谱-质谱联用仪(Agilent科技有限公司)，配在线脱气机、四元低压泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、电喷雾四级杆质谱检测器，仪器控制和数据采集分析使用ChemStation工作站；超纯水系统(历元电子仪器公司)，KS-300D 系列超声波清洗器，300W(科生仪器厂)。R2200型旋转蒸发仪(Buchi公司)；甲醇(分析纯)，四氢呋喃、甲醇(色谱纯，Merck公司)；NaCl、NaOH、石油醚(沸程30～60℃)、二氯甲烷(分析纯)；无水硫酸钠：使用前在500℃马弗炉中灼烧4小时；HCl(分析纯)；多菌灵标准品(Dr.Ehrenstorfer公司)。

标准溶液配制：准确称取标准品，用甲醇溶解配成浓度为100mg/L的标准储备液。使用时用甲醇逐级稀释成浓度为0.020～2.0mg/L的标准溶液。

样品预处理：准确称取粉碎混匀后的样品25.0g于100ml具塞三角烧瓶中，加入50ml甲醇和10ml 0.1mol/L HCl，搅拌均匀，超声振荡提取2小时，用布氏漏斗抽滤，以少量甲醇清洗残渣，合并滤液于150ml圆底烧瓶中，在40℃水浴上浓缩，基本除去甲醇。将浓缩液转移至125ml分液漏斗中，加入10ml 0.1mol/L盐酸和50ml 10% NaCl溶液，混合均匀，再加入25ml石油醚剧烈振荡。静置分层后，弃去石油醚，水相用2mol/L NaOH溶液调节pH至6.5～8.5，用二氯甲烷萃取3次，每次20ml。合并二氯甲烷，以无水硫酸钠干燥，将滤液转移至150ml圆底烧瓶中，在40℃水浴中减压蒸发至干，最后用甲醇溶解定容至1.0ml。

高效液相色谱-质谱条件：色谱柱，Dikma Diamonsil C18 (4.6mm i.d.×250mm，5μm)；流动相，4%四氢呋喃水溶液(A)∶甲醇(B)=7∶3；流速，0.6ml/分；柱温，30℃；检测波长，282nm；进样量，10μl。

质谱检测选择正离子选择离子检测(SIM)模式，以m/z192和m/z160为定性检测离子对，m/z192为定量检测离子，干燥气为氮气，流速10L/分，干燥气温度350℃，毛细管电压3500V，裂解电压100V。

结果与讨论

样品前处理条件的选择：多菌灵是一种两性化合物，在中性和偏碱性水溶液中溶解度低，微溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿等有机溶剂。实验比较了在酸性条件下，甲醇和水提取多菌灵的效果。取空白蔬菜，加入多菌灵标准溶液，然后分别用水和甲醇提取，同前述方法净化。结果甲醇-盐酸法回收率高，而水提法回收率不到50%，故选择醇提法。在甲醇中加入酸液使多菌灵成盐，用石油醚除去脂溶性物质。再加入NaOH溶液，调整pH至6.5～8.5，使多菌灵转成原形，再用有机溶剂萃取，从而达到纯化、富集多菌灵的目的。

流动相的选择：实验中发现以甲醇-水为流动相洗脱时，多菌灵峰型宽而且拖尾。经过反复实验，选择了四氢呋喃作为调节剂，使峰型得到改善；采用4%四氢呋喃水溶液(A)∶甲醇(B)=7∶3。

质谱方法的优化：实验发现，用DAD检测器在紫外波长282nm下进行检测，多菌灵信号被掩盖，无法准确定量。而用灵敏度和选择性更高的质谱检测器在选择离子监测模式下进行检测，多菌灵响应明显。与DAD检测器相比，质谱检测器采用SIM模式后，检测灵敏度显著提高，目标物在紫外光下无响应，但在质谱中有很强的响应。同时质谱抗干扰强，检出限低，定量结果更趋准确和真实，方法耐用性更强；用扫描模式在m/z 120～220范围扫描。质谱中的准分子离子m/z192[M+H]+为基峰，m/z16为[M-CH3O]+，m/z 214为[M+Na]+。因此，实验选取m/z192和m/z160作为监测离子对进行定性，将m/z192用于多菌灵的定量测定。

标准曲线及方法检出限：将标准储备液用甲醇稀释成浓度分别为0.02、0.04、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00、2.00、3.00和4.00mg/L的标准溶液。在相同的色谱及质谱条件下，测定多菌灵的峰面积。以峰面积对进样浓度作图，绘制标准校正曲线。在含量为0.02～4.00mg/L范围内得出标准曲线，线性回归方程为Y=5.028×107X+2.324×105，相关系数r=0.9994。取空白样品提取液，加入一定量的多菌灵标准品，以信噪比的3倍来确定方法的检出限为0.12mg/L(RSD<5%)。

实际样品的测定结果：测定结果见表1，多菌灵的平均加样回收率为95.5%～103.2%；最大相对标准偏差为4.3%。测定结果令人满意。不同产品中多菌灵的最高残留限量为0.5mg/kg，本方法的灵敏度完全能够达到分析要求。采用三波长分光光度法测定水果蔬菜中多菌灵的残留量，方法简单，测定结果准确，方法重现性好。

【参考文献】

1 张建新,杜双奎,杨小姣.陕西省主要蔬菜产区多菌灵农药残留分析与评价.安全与环境学报,2005,5(6):78-80.

2 李桂风,郝征红,董淑敏,等.花生中多菌灵残留量的高效液相色谱分析方法的研究.分析测试学报,1998,17(3):69-70.

3 Bernal J.L.,del Nozal M.J,et al.High-performance liquid chromatographic determination of benomyl and carbendazim residues in apiarian samples.Journal of Chromatography A,1997,787:129-136.

4 默涛,陈鹤鑫,陆贻通,等编著.农药残留量分析方法.上海:上海科学技术出版社,1992:201-203.